蛋白質(zhì)是與生命及各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)，機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)是由不同氨基酸以肽鍵相連所組成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)可分為以下4個結(jié)構(gòu)層次：
圖1 蛋白質(zhì)的四個結(jié)構(gòu)層次
我們所關(guān)注的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)分子局部區(qū)域內(nèi)，多肽鏈沿一定方向盤繞和折疊的方式，主要是分子內(nèi)的氫鍵維系的局部空間排列，包括α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等。
常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析的方法有四種：紅外光譜法、X射線衍射法、圓二色譜法和熒光光譜法，其中紅外光譜法的優(yōu)勢非常明顯，可以宏觀整體的鑒定復雜體系，測定不同狀態(tài)、不同濃度和不同環(huán)境中的蛋白質(zhì)和多肽，而且紅外光譜法是一種快速的無損檢測方法。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法應用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定性和定量分析已有幾十年的歷史，是一種非常成熟的檢測方法，人們對各類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)紅外吸收峰，以及同類蛋白質(zhì)不同組分的特種頻率和指認，都已非常明確，如下表所示。目前，蛋白質(zhì)紅外檢測方法已廣泛應用于藥物研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量控制和出廠檢測中。
表1 各類蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)紅外吸收峰
根據(jù)樣品的形態(tài)不同，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的紅外測試方法分為兩種：
1、液體樣品
常用配置為紅外光譜儀主機配套液體池附件和專門的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析軟件，還可以根據(jù)測試需要增加溫度控制系統(tǒng)，如下圖所示。
圖2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)檢測
紅外液體池及溫控裝置
2、固體樣品
常用配置為紅外光譜儀主機配套壓片機、衰減全反射（ATR）附件和測試軟件，含分峰、差減、求導、卷積、去卷積、曲線擬合等功能，或可根據(jù)測試需要配套帶溫控功能的ATR附件。
FTIR用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析實例已經(jīng)非常多，不僅可以對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行定性定量分析，如注射用人免疫球蛋白的檢測，也可以對由溫度、化學、物理和癌變等因素導致的變性蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析，下面力晶小天為大家舉幾個“栗子”：
人工抗原的鑒定
衰減全反射紅外光譜法可以實現(xiàn)原位測定和實時跟蹤，對于需要觀察過程反應的實驗具有很高的利用價值。通過對蛋白質(zhì)酰胺吸收帶的二階求導和去卷積等，可以觀察蛋白質(zhì)分子部分或全部去折疊引起的二級機構(gòu)的破壞以及相對含量的變化。對此，浙江農(nóng)林大學化學系的郭明等人合成致癌物氨基甲酸乙酯的人工抗原后，通過衰減全反射紅外光譜成功地對人工抗原蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及其含量進行了分析。利用FTIR對人工抗原化學結(jié)構(gòu)進行鑒定的應用很多，方法也非常成熟，除了ATR法，液體池法和壓片法也經(jīng)常被采用。
過敏原原肌球蛋白檢測
水產(chǎn)品中，蝦蟹(甲殼)類和貝類為水產(chǎn)品的主要致敏食物，而原肌球蛋白是其中主要的過敏原，其引起的過敏癥狀日趨復雜和嚴重。而傳統(tǒng)的檢測方法中，質(zhì)譜技術(shù)的儀器成本和操作要求高，并且用SDS電泳分離蛋白導致蛋白變性，對被檢食品樣品有損害；PCR檢測技術(shù)用來檢測加工食品可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果；免疫學檢測技術(shù)、膠體金試紙條檢測、磁性免疫層析法及生物傳感器檢測法等步驟繁瑣且都需要抗體。上海海洋大學的盧瑛等人發(fā)明了紅外衰減全反射法快速鑒定和檢測過敏原原肌球蛋白。
圖3 不同水產(chǎn)品的光譜
癌癥早期診斷
隨著FTIR技術(shù)的不斷進步，為癌癥的早期診斷提供了可能，針對這方面的報道也越來越多。例如，原發(fā)性膽囊癌細胞缺乏典型的臨床表現(xiàn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)屬中晚期，術(shù)后5年生存率不到5%。而早期原發(fā)性膽囊癌術(shù)后5年生存率可達100%，早期診斷是提高療效、改善預后的關(guān)鍵。西安交大醫(yī)學院diyi附屬醫(yī)院普外科的孫學軍等人通過賽默飛世爾的紅外光譜儀試驗發(fā)現(xiàn)，膽囊癌組織與正常膽囊組織的紅外光譜具有顯著差異，可作為癌癥早期診斷的手段。
中科院同步輻射實驗室的馬曉冬等人認為檢測細胞和組織樣品取樣較為不便，所以根據(jù)中醫(yī)理論——人的指甲在一定程度可以反映出內(nèi)臟器官的生理病理變化，建立了通過指甲紅外光譜判斷消化道癌的方法。之前還有人通過指甲的紅外光譜，對鼻咽癌進行早期診斷。
結(jié)直腸癌化療療效的實時監(jiān)測
在結(jié)直腸癌的化療中，常采用5-氟尿嘧啶誘導腫瘤細胞凋亡。臨床上對放化療效果的監(jiān)測主要是通過電子顯微結(jié)腸鏡、CT和B超等手段，只是在組織水平進行監(jiān)測，而組織變化之前腫瘤細胞內(nèi)部構(gòu)成早已發(fā)生改變，尚未出現(xiàn)臨床癥狀和影像學改變。西安交大醫(yī)學院diyi附屬醫(yī)院普外科的劉棟等人利用賽默飛世爾的iN10 MX型顯微紅外光譜儀，對不同時期腫瘤細胞中的脂類、氨基酸殘基、DNA和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等進行檢測，研究出實時無創(chuàng)監(jiān)測腫瘤化療療效的有效方法。
圖4 隨凋亡時間延長蛋白質(zhì)α螺旋和NH二級結(jié)構(gòu)吸收峰強降低，
提示細胞α螺旋解鏈，細胞凋亡（a: Control; b: 12h; c: 24h; d: 48h）
不同制備條件對抗體蛋白的影響
免疫膠乳指特定抗體或抗原固定于膠乳顆粒表面形成具有免疫學性質(zhì)的膠乳顆粒。傳統(tǒng)物理吸附法固定大分子蛋白容易脫落，用共價偶聯(lián)的方法制備免疫膠乳，蛋白質(zhì)在吸附于膠乳顆粒表面的過程中結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，不同偶聯(lián)條件對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)影響不同。華南理工大學的俞思明等人利用壓片法測得免疫膠乳的紅外透射光譜，并結(jié)合多種算法，分析了不同條件下共價偶聯(lián)對抗體蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。
隨著FTIR軟件和硬件技術(shù)的不斷進步，相信未來紅外光譜法在蛋白質(zhì)檢測各領(lǐng)域中的應用也會更加普遍，同時將由離體分析蛋白質(zhì)向在體分析方向發(fā)展，這對化學和醫(yī)學領(lǐng)域都將具有重大意義。
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